小动物活体成像之生物发光成像是基于萤光素酶的发光原理，将编码萤光素酶的基因转到细胞内，实现对萤光素酶的表达。生物发光成像具有无自发荧光干扰、无需剃毛或提前禁食、灵敏度高、检测深度高、可进行精确定量等多种独特的优势，近年来被广泛应用于小动物活体成像实验。

生物发光成像实验一共包括六个步骤，那让我们一起来看看小动物活体成像之生物发光成像实验流程吧！

一、确定萤光素酶

常见的荧光素酶包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，Fluc）、海洋蛋白质荧光素酶（Renilla luciferase，Rluc）和高司氏荧光素酶。它们在特定条件下都能催化各自的底物产生相应的光，而无需外部激发器。其中，Fluc是应用最为广泛的荧光素酶。

D-Luciferin是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，Fluc）最常用的底物，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下通过萤火虫萤光素酶的作用进行氧化脱羧反应发出蓝绿色生物萤光。

推荐使用Goldbio的D-荧光素钾盐（D-Luciferin, Potassium Salt）做为萤火虫荧光素酶的底物。

二、构建稳转萤光素酶细胞株

目前广泛应用的构建稳定细胞株的方法是采用慢病毒感染-药物筛选法，该方法具有整合高效、目标细胞广泛等特点。

推荐使用中科百抗的PolyTool™ VIS Packaging Transfection Reagent进行病毒包装后进行后续实验。

三、验证稳转株

构建得到稳转株后，可以进行体外实验以验证Fluc稳转株效果。可以将生长良好的Fluc细胞消化，随后用培养基稀释成系列梯度浓度并分别接种于96孔板中，每孔100 μL，每个浓度设置三平行孔。检测时可以选择两种方式进行：

方式一：用无菌的DPBS (不含钙镁离子) 配制D-Luciferin钾盐储存液（15 mg/mL），混匀后用0.2 μm滤膜过滤除菌备用。检测时去除孔内培养基，加入稀释的D-Luciferin钾盐溶液（如150μg/mL），孵育3-5 min后通过小动物活体成像仪（如IVIS）测定各孔的发光强度。

方式二：通过报告基因检测试剂盒进行检测。此时细胞被裂解，获得的信号强度一般会比直接加入底物检测更高。

四、稳转株注射动物

成功构建稳转株后，即可进行动物移植模型构建，操作流程如下图所示：

五、注射底物荧光素

注射的细胞一般会在2-3周成瘤（具体时间根据细胞种类，接种数量，细胞活力会有所不同），可以根据实验设计进行一定处理。一般推荐150 mg/kg的使用浓度对小鼠进行腹腔注射，10-15 min后进行活体成像分析。

六、活体成像

建议使用带有麻醉装置的小动物活体成像仪进行活体成像，具有操作方便、准确控制小鼠麻醉情况等优点。若采用的是不带麻醉装置的小动物活体成像仪，可先麻醉小鼠再进行成像，但需要注意防止检测途中小鼠中途苏醒而离开成像台。

更多有关小动物活体成像之生物发光成像实验流程的问题，请联系可以提供D-荧光素钾盐（D-Luciferin, Potassium Salt）和中科百抗转染试剂（PolyTool™ VIS Packaging Transfection Reagent）的公司——北京百奥创新科技有限公司。