Northern Blot（又称Northern印迹杂交）是一种实验技术，用于检测特定RNA序列，通常用于研究基因表达，是分析mRNA最常用的经典方法。这项技术可以观察RNA的性质、大小和丰度，从而更加深入地了解基因表达水平。本文将分享Northern Blot的实验原理以及实验流程，赶快来学习吧！

一、Northern Blot原理

在变性条件下，将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，然后将其转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，在固定后与同位素或其他标记物标记的RNA探针反应。

二、Northern Blot实验流程

需要准备的试剂：

（一）RNA样品的提取

获得高质量完整的RNA是进行Northern Blot的关键步骤。可以使用Trizol法提取或使用相应的RNA分离试剂盒进行提取。

（二）RNA样品的制备

取适量总RNA，加入 5×甲醛凝胶电泳缓冲液、37%甲醛、甲酰胺，65℃温育15分钟，冰浴5分钟。加入1μg/μL EB和上样缓冲液。

（三）凝胶的制备

取0.2g琼脂糖，加入12.4mL DEPC水，加热熔化，于55℃保温状态下加入4mL 5×甲醛凝胶电泳缓冲液、3.6mL 37%甲醛，混匀、制胶。待凝胶固化后，置于1×甲醛凝胶电泳缓冲液中进行预电泳5分钟。

（四）电泳

上样，电泳。电泳结束后，将凝胶块放置在紫外灯下，观察RNA的完整性，使用扫胶仪记录18S和28S条带的位置。

（五）转移

将RNA从凝胶块转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。可采用毛细转移法或电转移法。

（六）固定膜

将膜放置于80℃下真空干燥1-2小时。干燥后的膜用塑料袋密封，保存在4℃备用。也可以使用紫外线照射进行固定。

（七）杂交和洗膜

（1）探针标记：

取适量模板DNA变性后，与dNTP混合液、BSA、5×缓冲液、Klenow酶、α-32P-dCTP以及适量dd H2O，轻轻混匀。室温下反应1小时。

（2）预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液，预杂交3小时。

（3）杂交：将变性的探针（95-100 ℃变性5 分钟，冰浴5 分钟）加入到预杂交液中，42 ℃杂交16小时。

（4）洗膜：洗涤膜以去除非特异性杂交。

（八）检测

将膜用清水漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70 ℃放射自显影3～7天左右。

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