新发现：非小细胞肺癌具有极端的免疫多样性！

在恶性肿瘤中，肺癌在全球发病率和死亡率位居前列，特别是非小细胞肺癌（NSCLC），占比高，且存在高度侵袭性、异质性，而且组织学亚型复杂和突变特征明显。

肿瘤微环境的异质性在单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步下，也逐渐被解剖。但是单细胞RNA测序（scRNA-seq）存在样本量有限，缺乏基因组数据和长期随访数据，因此在分析肿瘤微环境生物的异质性、药物耐药性等方面较为片面。

在NSCLC肿瘤微环境中，白细胞是重要的细胞类型，根据往期实验数据得出：中性粒细胞在瘤内驻留白细胞中占比8%-20%。但是，单细胞RNA测序（scRNA-seq）在中性粒细胞方面的研究较少，因此，加强NSCLC 肿瘤微环境中中性粒细胞的研究，意义重大。

最近，奥地利因斯布鲁克医科大学的Zlatko Trajanoski和Andreas Pircher研究团队在Cancer Cell发表题为《High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer》的论文，研究发现：中性粒细胞（TRNs）亚群在NSCLC的肿瘤微环境中具有不同的功能特性，尤其是，TRNs的基因标记与免疫检查点抑制剂治疗的不良预后相关。 

该研究团队根据公开的scRNA-seq数据集，对比自己团队的NSCLC数据集（UKIM-V），根据大数据，进行全面的分析，整合出一个全新的NSCLC单细胞核心图谱。在该图谱中，转录组数据为298名(212名NSCLC患者,86名对照者),肿瘤样本数据为364个（196个肿瘤样本，168个非肿瘤）。在212名NSCLC患者中，肺腺癌（LUAD）为156人，占比73.6%；肺鳞状细胞癌（LUSC）为41人，占比19.3%。

根据NSCLC核心图谱的研究结果跟流式细胞分析数据一致,说明：中性粒细胞群仅占所有细胞的1.5%，但是图谱里78%的中性粒细胞来自UKIM-V数据集，其中中性粒细胞分别占UKIM-V所有细胞的12%和所有白细胞的18%。中性粒细胞表达的mRNA分子量极低，发现是由于其半衰期较短，仅为7-10小时。对比多种测序结果发现，BD Rhapsody平台捕获的mRNA分子数量要丰富得多，因此可能更适合检测低mRNA含量的细胞。

结合上述结果，该研究团队利用BD Rhapsody平台测序的UKIM-V队列数据和中性粒细胞的转录组特征进行进一步研究，发现：LUSC中中性粒细胞比例明显较高，而LUAD中巨噬细胞、CD4 T细胞、2型肺泡细胞、过渡型棒状细胞/2型肺泡细胞（transitional club/AT2）更为丰富。

根据患者肿瘤微环境浸润模式，该研究团队将NSCLC患者分为了四个类别：免疫荒漠型、B细胞优势型、髓系细胞优势型、T细胞优势型。其中，免疫荒漠型没有明显的免疫细胞浸润，但肿瘤细胞比例高；B细胞优势型主要为B细胞、浆细胞和肥大细胞；髓系细胞优势型主要为巨噬细胞和单核细胞；T细胞优势型主要为CD8 T细胞、CD4 T细胞和调节性T细胞。不同免疫表型也表现出具有差异性的细胞因子信号特征。

根据早期的研究结果发现，LUAD以炎症状态为主，LUSC伤口愈合状态为主。根据细胞-细胞通信网络的差异，该研究团队进一步实验发现：LUAD以KDR（VEGFR2，血管内皮细胞生长因子受体2）-VEGFA（血管内皮生长因子A）通信上调为特征，通过促进血管生成，开启免疫抑制信号，而LUSC则以SPP1（分泌型磷蛋白1）和JAG-NOTCH信号通路上调为主要特征，前者促进肿瘤转移，后者通过募集中性粒细胞调节肿瘤免疫微环境。

根据TCGA队列数据的分析，发现转录组与生存数据之间的关系：肿瘤B细胞的富集度与NSCLC患者的良好预后成正相关，而中性粒细胞则呈负相关；而CD8 T细胞亚型的分析显示，幼稚CD8 T细胞与良好预后呈正相关。

根据对NSCLC中TRNs的异质性细胞亚群的鉴定发现：肿瘤相关中性粒细胞（TANs）和邻近正常组织相关中性粒细胞（NANs）的表达谱特征不同，且中性粒细胞是肿瘤微环境中VEGFA的主要来源，印证了TRNs重要的促血管生成作用。

同时该研究团队还发现：TANs中凝集素型氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）表达升高，肿瘤组织中存在较多的LOX-1+细胞浸润，但在匹配的相邻的正常肺组织中未发现LOX-1+细胞浸润，说明LOX-1可能是一种特异性的TANs标记物。

为了深入解析TRNs不同亚群的异质性，研究团队继续对图谱中TRNs进行聚类分析，鉴定出了4个TAN亚群和3个NAN亚群。

值得注意的是，TAN-2亚群CD274（PD-L1）/PDCD1（PD-1）信号通路显著上调，提示了TAN对CD8 T细胞的免疫抑制作用，这与过去报道的中性粒细胞的富集与抗PD-1/PD-L1治疗无应答有关的结果一致。

为了确定TRNs在NSCLC患者中的预后价值，研究团队分析NSCLC患者治疗前肿瘤的RNA-seq数据，这些患者经历了抗PD-L1抗体或化疗药单药治疗。结果显示，TRN基因标记与抗PD-L1治疗应答和生存预后呈明显负相关（p=0.003），但在化疗组中并不显著。

综上所述，这个研究从单细胞层面全面剖析了NSCLC肿瘤微环境，一方面，分析了中性粒细胞群对肿瘤微环境中具有不同功能特性的TRNs亚群进行深入表征，另外一方面，弥补了基因组数据以及长期随访数据，揭示了中性粒细胞与免疫治疗抵抗和不良生存结局的关联，为后续开发中性粒细胞耗竭剂奠定了基础。

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